Il DNA è la molecola che contiene le informazioni genetiche degli organismi e la sua struttura è costituita da quattro diversi nucleotidi (adenina, citosina, timina e guanina) ad ognuno dei quali corrisponde una lettera; il sequenziamento è la metodica che permette di leggere ed ordinare le singole lettere, identificando così una sequenza di nucleotidi. La possibilità di sequenziare frammenti di DNA ha applicazioni utili in diversi campi che spaziano dalle scienze forensi a quelle alimentari e non per ultime alle scienze mediche, impattando sulla diagnosi e sulla caratterizzazione della malattia nelle diverse fasi.
Lo sviluppo del sequenziamento risale agli anni 70, grazie alle ricerche del chimico Frederick Sanger, padre della metodica “Sanger”, utilizzata ancora oggi per le procedure diagnostiche di base. L’avanzamento tecnologico ha permesso di ampliare l’estensione delle sequenze analizzate, passando da piccoli frammenti (sequenziamento Sanger) a frammenti sempre più lunghi fino ad arrivare all’intero genoma. La tecnologia di ultima generazione, ovvero “next generation sequencing” (NGS), acquisita a livello globale dai centri di Ricerca traslazionale a partire dagli anni 2000, è caratterizzata da una più elevata sensibilità rispetto al convenzionale sequenziamento Sanger in quanto in grado di generare centinaia di milioni di sequenze in una sola seduta.
La procedura analitica prevede diverse fasi, alcune propriamente tecniche come preparazione della libreria, ovvero amplificazione del materiale genomico di partenza, e fase di sequenziamento mediante un sistema di rilevazione dell’incorporazione dei nucleotidi, a cui segue l’analisi bioinformatica delle sequenze nucleotidiche ottenute. Attualmente la fase analitica maggiormente critica è rappresentata proprio dall’analisi bioinformatica che, nonostante gli sviluppi della Ricerca, continua a presentare problematiche inerenti alle impostazioni di filtri di qualità ed identificazione delle alterazioni e della loro frequenza nel campione analizzato, ed alla necessità di potenti server di archiviazione dei dati genomici.
Nonostante le problematiche, il next generation sequencing è entrato a far parte dei percorsi diagnostici in campo ematologico; nel laboratorio di biologia molecolare dell’Istituto Seràgnoli si effettuano analisi di sequenziamento sul DNA dei Pazienti affetti da leucemia mieloide acuta.
Questa patologia include un ampio gruppo di neoplasie del sangue che coinvolgono i precursori ematopoietici della linea mieloide, rappresentata da granulociti, monociti, eritrociti e megacariociti ed è caratterizzata da una proliferazione clonale di questi precursori che presentano una capacità ridotta di differenziarsi in elementi cellulari più maturi. Questo determina un accumulo di forme immature nel midollo osseo, nel sangue periferico e talvolta in altri tessuti, con una riduzione variabile nella produzione di normali globuli rossi (anemia), piastrine (trombocitopenia) e granulociti maturi (neutropenia), con o senza leucocitosi. La LAM è una patologia complessa: alla base di questa troviamo una estrema varietà di anomalie genetiche ed epigenetiche che influenzano le scelte terapeutiche e la risposta alla terapia. Inoltre alcune mutazioni sono associate ad una prognosi migliore ed altre ad una prognosi sfavorevole. Le anomalie genetiche ed i profili di espressione genica alterata, acquisiscono quindi importante significato prognostico per i Pazienti affetti da LAM.
In conclusione, le metodiche di sequenziamento, sia Sanger che la più moderna NGS, sono al giorno d’oggi indispensabili allo scopo di identificare alterazioni implicate nello sviluppo della malattia e/o funzionali ad una più accurata stratificazione del rischio, con conseguente modulazione dell’intensità di trattamento, o che possano rappresentare target specifici di terapia o spiegare una non efficacia del trattamento.